蟒蛇肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

亚洲岩蟒主要栖息在热带与亚热带森林,具有较高的药物、营养和经济价值,人工养殖中常因肺炎而死亡.为调查该病病因,对海南省养殖场发病蟒蛇进行心脏穿刺采集血样、细菌培养、革兰氏染色镜检、16S rRNA基因序列测定和BLAST分析等方法寻找病原,结果表明,分离菌株为肺炎克雷伯氏菌.     

杨梅污染肺炎克雷伯氏菌的分离及其耐药特征和毒力基因

杨梅在生产与运输过程中易受到病原菌的污染,为分析杨梅中肺炎克雷伯氏菌的携带情况及肺炎克雷伯氏菌的耐药特征和毒力基因,分别从杭州市场和杨梅生产基地采集90份杨梅样品,测定大肠菌群污染状况,使用梅里埃VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定仪和16S rRNA测序方法鉴定肺炎克雷伯氏菌,采用VITEK 2阴性菌药敏卡对所获得的肺炎克雷伯氏菌进行耐药表型分析,PCR扩增检测耐药基因和毒力基因。结果表明:90份样品中共有51份样品存在大肠菌群污染,污染率为56.7%,有9株肺炎克雷伯氏菌,检出率为10%,其中8株肺炎克雷伯氏菌聚为一簇。9株肺炎克雷伯氏菌对氨苄西林、头孢唑林和呋喃咀啶均呈不同程度的耐药,尤其是氨苄西林耐药率达88.89%。9株菌株均携带tetA基因,检出blaTEM、gyrA、aadA1和aac(6')-1b耐药基因的阳性率均为88.89%,blaCTX-M、floR、ereA、ermB和mecA等耐药基因未检出,毒力基因wcaG、magA、rmpA和菌素未检出。综上,杨梅中存在一定的肺炎克雷伯氏菌污染,但这些菌株未携带wcaG、magA、rmpA等毒力基因和菌素。     

黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白 A 的原核表达与纯化

【目的】克隆黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A(KpOmpA)基因,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取重组蛋白KpOmpA,为黄喉拟水龟抗肺炎克雷伯菌的相关疫苗研究奠定基础。【方法】以黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌DNA为模板,克隆获得KpOmpA基因后与pET-32a表达载体连接;将构建的重组质粒pET-32aKpOmpA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,通过SDSPAGE电泳检测KpOmpA重组蛋白的表达情况,并对重组蛋白进行可溶性分析;经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化KpOmpA重组蛋白,应用Western blot方法鉴定纯化蛋白。【结果】KpOmpA基因CDS序列全长为1 071 bp,推定编码356个氨基酸,与其他肺炎克雷伯菌的OmpA氨基酸序列同源性超过99%,高度保守。重组质粒pET-32a-KpOmpA经双酶切、测序确认基因序列无移码或突变,表明重组质粒成功构建。转化后的BL21感受态细胞经终浓度为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明,KpOmpA重组蛋白大量表达,以包涵体形...     

兔源支气管败血波氏杆菌和肺炎克雷伯菌的分离鉴定及其对抗菌药物的敏感性分析

兔感染支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）后，常引起兔多发性呼吸道疾病，严重危害家兔养殖业。作者剖检河南省某兔场疑似病死兔，并采集组织分离鉴定病原菌，然后进行药敏试验，以期确定引起兔呼吸困难、腹泻的病原。结果显示，经细菌分离培养得到1株革兰阴性、两端钝圆的小杆状可疑致病菌及1株革兰阴性、卵圆形的可疑致病菌；其16S rRNA基因序列扩增片段大小分别为1 492和1 494 bp，与B. bronchiseptica AU 12671和K. pneumoniae菌株F5feb.57相似性分别为99.85%和100.00%，即该兔场患病兔为B. bronchiseptica和K. pneumoniae混合感染。药敏试验结果显示所分离的B. bronchiseptica和K. pneumoniae同时对庆大霉素、头孢曲松、头孢唑啉3种药物敏感，对其他药物有不同程度的耐药性。综上表明，此次分离的细菌为B. bronchiseptica和K. pneumoniae，本试验为家兔B. bronchiseptica和K. pneumoniae混合感染的分离鉴定及科学用药提供参考。     

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E溶磷基因GDH和pqqE的克隆及溶磷特性分析

葡萄糖脱氢酶（GDH）和吡咯喹啉醌（PQQ）对溶磷微生物溶解无机磷具有重要作用。本研究为了探讨甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯菌（Klebsiella variicola）DX120E的溶磷机制,从该菌中克隆溶磷基因GDH和pqqE的ORF,并进行了生物信息学分析,同时还研究了该菌对不同磷源的利用能力。结果表明：克隆得到甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E GDH和pqqE基因的ORF分别为2373 bp和1143 bp,编码氨基酸分别为790个和380个。生物信息学分析结果表明,GDH蛋白为稳定蛋白,pqqE蛋白为不稳定蛋白。GDH蛋白是一个与细胞信号传导有关的膜受体蛋白,具有PQQ_membr_DH、PQQ_mGDH功能域和PQQ_DH_like超家族蛋白结构;pqqE基因编码的蛋白是胞内蛋白,含有1个PQQ_syn_pqqE功能域和Radical SAM超家族蛋白的结构。内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E对不同磷源的利用和GDH和pqqE基因在不同磷源培养时的qRT-PCR分析表明,该菌对不同磷源的溶磷能力表现为FePO₄>AlPO₄>Ca₃(PO₄)₂,且溶解FePO₄的能力与溶解Ca₃(PO₄)₂、AlPO₄等难溶磷源的差异均显著（P<0.05）。在几种磷源条件下,GDH和pqqE基因相对表达量均增加,且2个基因的表达量变化趋势一致。GDH和pqqE基因在以FePO₄为磷源条件下的表达量与以Ca₃(PO₄)₂为磷源的表达量差异显著（P<0.05）。本研究可为进一步研究内生固氮菌与甘蔗的互作和溶磷机制提供参考。     

甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nifH基因的克隆与序列分析

【目的】了解甘蔗内生固氮菌变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的生物信息学,为揭示甘蔗内生固氮菌DX120E的固氮分子机理提供理论依据。【方法】根据NCBI上其他固氮菌株的nif H序列设计引物,对内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E菌进行PCR扩增;运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析,并对其蛋白结构进行预测。【结果】甘蔗内生固氮菌Klebsiella variicola DX120E nif H基因的ORF为882bp,Gen Bank登录号为KF732646.1,与Klebsiella pneumoniae 342、Klebsiella variicola At-22等6种固氮菌的nif H基因氨基酸序列同源性高达95.0%-99.0%。DX120E nifH蛋白与Klebsiella pneumoniae 342的亲缘关系最近,与非克雷伯氏菌固氮菌的亲缘关系较远。生物信息学分析显示,菌株DX120E的nif H基因编码293个氨基酸,起特别重要的氨基酸残基非常保守。该基因在N端有11个氨基酸残基即酪氨酸—甘氨酸—赖氨酸—甘氨酸—甘氨酸—异亮氨酸—甘氨酸—赖氨酸—丝氨酸—苏氨酸—苏氨酸,其属于典型结合ATP的基序结构。nif H蛋白分子量为32.07k D,pI为4.92,为酸性蛋白;其具有2个ASN糖基化位点,1个CAMP磷酸化位点,6个CK2磷酸化位点,6个PKC磷酸化位点。疏水性预测显示该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽。【结论】变栖克雷伯氏菌（Klebsiella variicola）DX120E nif H基因的推导氨基酸序列与克雷伯氏菌固氮菌属具有较高的同源性,该基因在甘蔗生物固氮过程中可能起重要作用。     

Isolation of an endophytic diazotroph,Klebsiella oxytoca,from sweet potato stems in Japan

Abstract

The population density of endophytic bacteria in the stem of field-grown sweet potato cultivars (Beniotome [BO], Koganesengan [KS], and Shiroyutaka [SYD in Miyakonojo, Miyazaki, Japan, ranged from 10² to 10⁴ cells g^?1 fresh weight sample using a semi-solid nitrogen-free medium. Eleven strains were isolated from the stems and two isolates, BO-1 and BO-5, showed a positive reaction in the acetylene reduction activity (ARA) test. BO-1 and BO-5 were isolated from cv. Beniotome in September 1999 and 2000, respectively. Morpho-physiological characterization of these isolates revealed that BO-1 and BO-5 showed a similar colony color in potato sucrose agar slants, produced bubbles in a modified semi-solid medium, acidified the medium, and displayed similar characteristics using the API 20NE rapid diagnostic kit. Partial sequence analysis of 16S rRNA from BO-1 revealed a 100% similarity (491 bp) to that of Klebsiella oxytoca. The other 9 isolates showed a negative reaction in the ARA test, slightly acidified or did not acidify the medium. Partial sequence analysis of the 16S rRNA revealed that the isolate SY-2 corresponded to Methylobacterium sp. (99.3% similarity for 1,241 bp), BO-3 to Pantoea agglomerans (99.1% similarity for 469 bp), and BO-8 to Sphingomonas sanguinis (98.8% similarity for 419 bp).     

Isolation of Histamine-Producing Bacteria from Fish-Processing Facilities and FishingVessels

Abstract

The presence of histamine-forming bacteria in fishprocessing facilities was studied. Environmental sampling was conducted in the Hampton Roads area of Virginia in fishprocessing facilities that regularly handle scombroid fish or other fish which are known to potentially accumulate histamine levels greater than 50 ppm. Surfaces that come into contact with the fish were swabbed and the histamine-forming isolates from these areas were identified. One isolate each of Klebsiella ozaenaeand Vibrio alginolyticus, and two isolates of Aeromonassp. were found in the processing facilities. The study concluded that histamine-forming bacteria do not comprise a large part of the microflor a associated with fishprocessing facilities. Fishing vessels were also sampled and no histamine-forming bacteria were identified.     

弗兰克氏菌nifH及nifD基因的定位

利用限制性内切酶酶切和分子杂交等手段,对弗兰克氏菌菌株At4和Hr16的固氮基因克隆的nifH(pPC1201)、nifD(pPC1202)及nifK(pPC1203)基因为探针杂交,定位了At4和Hr16的nifH和nifD基因。同时发现,一条1.3kb的BamHI片段丢失。